INTRODUCCIÓN

    La realidad científica dista de la realidad clínica unos diez años. Cuando, por ejemplo, se descubre un potencial fármaco, éste debe pasar una serie de ensayos preclínicos (en  cultivos celulares y animales) y clínicos (en humanos) que evalúen su toxicidad, efectos secundarios, valoren su eficacia, esquema y vía de administración, etc. Estos ensayos son necesarios porque validan su potencial terapéutico y garantizan seguridad, pero son muy largos y muy costosos.

    Varios hitos están revolucionando la investigación en el campo de la Oncología. La secuenciación del genoma, el desarrollo de técnicas de estudio de la expresión global de genes (biochips o microarrays) y proteínas, la generación de anticuerpos monoclonales, mejoras técnicas en la Resonancia Magnética Nuclear (RMN) y la Tomografía por Emisión de Positrones (PET), así como la generación de nuevos agentes de contraste y trazadores, permiten una detección precoz en ciertos tipos de cáncer. Nuevos avances en Bioinformática y Biología Estructural nos permiten estudiar la morfología de las distintas proteínas y macromoléculas involucradas en los procesos neoplásicos.

    Uno de los mayores avances es, sin lugar a dudas, la generación de modelos de ratón que mimetizan las distintas etapas del desarrollo tumoral. Esto está siendo posible gracias al desarrollo en las técnicas de ingeniería genética, muy especialmente a la recombinación homóloga en células madre embrionarias y al descubrimiento de nuevas herramientas genéticas como los nuevos "genes reporteros", que nos indican dónde y cuándo nuestro gen de estudio se está expresando, incluso sin necesidad de sacrificar al animal.

    Hoy en día somos capaces de activar e inactivar genes en un solo tipo celular y en el momento deseado. La secuenciación del genoma de ratón y nuevas tecnologías de clonación de genes están siendo muy importantes, ya que favorecen la generación de modelos que mimetizan mejor y, además, se producen en un tiempo menor. Estos modelos, además de acercarnos al conocimiento de la Biología Molecular del cáncer, sirven como modelos para la validación de nuevos fármacos en ensayos preclínicos.

    Todos estos avances del conocimiento en Oncología Molecular permiten hacer un diseño más racional de fármacos al tiempo que se aceleran los ensayos preclínicos y se mejoran el diagnóstico, el pronóstico y el tratamiento de los tumores.

EL RATÓN, UN MODELO ANIMAL PARA ESTUDIAR EL CÁNCER.

    En investigación casi cualquier especie animal puede servir como modelo si se adapta al problema que queremos estudiar. A grandes rasgos, la anatomía de un ser humano “no difiere” de la de un caballo, un cerdo, un perro o un ratón. Histológicamente,  salvo matices muy especiales, los mamíferos somos muy parecidos y generalmente padecemos enfermedades muy parecidas con remedios similares (salvo la eutanasia).

    Además los modelos animales que empleamos han de presentar características que les den ventajas sobre otros modelos como son:

-  Fácil manejo.

-  Que requieran no demasiados cuidados.

-  Tamaño.

-  Características reproductivas (número de crías, periodo de gestación, tiempo necesario hasta el destete).

    Un buen modelo ha de presentar otras características según el problema que desee estudiar. Se emplea  el nematodo  C. elegans para estudiar apoptosis (muerte celular programada) porque es un gusano de 1090 células y siempre mueren las mismas (131) en el mismo lugar y la misma etapa del desarrollo. Se trabaja con el pez cebra (Danio rerio) para estudiar las primeras fases del desarrollo  embrionario porque es transparente y crecen fuera de un útero.

    Si definimos conceptualmente el cáncer como un “Conjunto de enfermedades genéticas adquiridas donde unos genes que controlan la división celular se alteran.” el mejor sistema modelo es el ratón ya que presenta otras características “no clásicas” como tener el genoma secuenciado y la posibilidad de ser manipulados genéticamente.

HISTORIA DEL RATÓN DE LABORATORIO.

        El empleo del ratón en el laboratorio no es nuevo:

• Hace más de 300 años en China y Japón se coleccionan ratones con malformaciones.

• Hacia el 1800 se seleccionaron cepas según el color del pelaje. Estudiando las leyes de Mendel, Castle observó que desaparecían ciertos pelajes con la gestación.

• En los años 30 se cruzaron ratones de forma endogámica para que fueran “genéticamente” idénticos (aún no se llamaban genes).

• Durante todo el siglo XX se identificaron “mutantes espontáneos” en las colecciones de ratones endogámicos  y se consiguieron identificar que genes predisponían a algunas patologías. Gracias a ellos se empezaron a conocer las causas genéticas de enfermedades como el cáncer, la obesidad y la aterosclerosis.

    Pero éramos víctimas del azar de estos mutantes espontáneos hasta que se produce una revolución tecnológica en los años 80.

• 1982  Palmiter y Brinster generan el primer ratón transgénico.

• 1981: Obtención de las primeras células madre embrionarias (ES, Embryonic Stem cell) a partir de blastocistos de ratón.

• 1984: Demostración de que estas células eran capaces de contribuir eficientemente a distintos órganos y tejidos incluyendo la línea germinal.

• 1986: Primera manipulación genética de las células madre embrionarias. Células que habían integrado retrovirus eran capaces de transmitirlos en la línea germinal. Un marcador de resistencia a neomicina (neo) integrado en el genoma de las ES cells se transmitía a la línea germinal. Transgénesis por medio de ES cells.

• 1987: Obtención de líneas de ratón con mutaciones en genes específicos. Primeros experimentos de manipulación genética en el ratón mediante “gene targeting” y recombinación homóloga en células ES.

• 1990: Transmisión a línea germinal de una mutación obtenida por recombinación homóloga en células ES.

LOS GENES Y EL CÁNCER.

    Antes de hablar de transgénesis debemos entender el concepto de un gen.

    Pese a que todas nuestras células contienen la misma información genética en su ADN, tenemos células de muy distintos tipos. Esto se debe a que expresan distintos genes. Un gen es una secuencia o fragmento de molécula de ADN que especifica al menos una función en la célula, una actividad que ejercen las proteínas. Existen mecanismos que regulan la expresión de los genes.

    Para entender fácilmente qué es un gen, podemos dividirlo en:

• PROMOTOR: contiene las secuencias reguladoras. Controla dónde (en qué células) y cuándo ha de “expresarse” un gen (estado embrionario, adulto, tras una determinada señal celular…).

• EXONES: llevan la información “real” que codifica para una proteína. Éstos incluyen el codon iniciación, terminación y señal de poliadenilación.

• INTRONES: se intercalan entre los exones, no tienen información para codificar proteína.

    He definido anteriormente el cáncer como un “conjunto de enfermedades genéticas adquiridas donde unos genes que controlan la división celular se alteran”.

    El resultado final de estas alteraciones genéticas presentes en los tumores es la expresión anormal principalmente de los oncogenes, los genes supresores de tumores y los genes de reparación del ADN.

    Los oncogenes son formas mutadas de genes normales (proto-oncogenes). Al mutar éstos se convierten en oncogenes y originan proteínas con función alterada favoreciendo la proliferación escapando de los puntos de control en el avance en el ciclo celular.

    Los genes supresores de tumores controlan, frenan, el ciclo celular, evitando así un crecimiento excesivo y  manteniendo las características que especifican la localización de la célula dentro de un tejido. Estos genes inducen la aparición de tumores cuando, al mutar, se producen formas no funcionales de la proteína o dejan de expresarse (generalmente por pérdida de un fragmento de ADN).

    Un crecimiento celular descontrolado, que es la raíz de un tumor, puede originarse tanto por la expresión anormal o excesiva de los productos de los oncogenes como por una producción nula, limitada o alterada de las proteínas codificadas por los genes supresores de tumores.

    Si se producen fallos en los genes de reparación del ADN, éstos serán incapaces de corregir otros daños en el ADN como, por ejemplo, alteraciones en otros oncogenes y genes supresores, de ahí el papel de estos genes en el desarrollo tumoral.

MODELOS TRASGÉNICOS CONVENCIONALES

    La transgénesis convencional o clásica consiste en introducir un gen en un cigoto. Este gen, al que llamaremos “transgén” puede ser de la misma especie o  de otra diferente, incluso de  una bacteria o una planta.

    También puede ser una “construcción artificial”. Podemos por ejemplo, utilizar el promotor (secuencias reguladoras) de un gen y la secuencia codificante (los exones) de otro.

    Para generar un modelo de ratón para estudiar los tumores de hígado, podemos cortar con enzimas de restricción (tijeras de ADN que cortan en secuencias específicas) un promotor de un gen que se expresa en los hepatocitos y pegarle, con una ligasa (una proteína que pega ADN), las secuencias codificantes (exones) de un oncogén.

    Este transgén se microinyecta en un cigoto de ratón y éste se integra al azar y en un número variable de copias en el genoma. El ratón que nace del cigoto microinyectado no tiene el transgén en todas sus células, se dice que es un ratón “mosaico”, el transgén se segrega por cruces.

    Así, en la transgénesis clásica se produce:

• Integración estable y al azar de un transgén.

• Conduce a la expresión ectópica o a la sobre expresión de un gen heterólogo o de un gen ya presente en el genoma.

    Hay diversas técnicas como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o Southern Blot para  estudiar si se ha incorporado el transgén ya que el ADN que hemos introducido es diferente (contenido y tamaño) o está en otro sitio.

    Sin embargo esta tecnología tiene sus limitaciones:

• No hay control sobre el sitio de integración del transgén ni el número de copias que se integran.

• El fenotipo resultante puede ser causado por la posición de integración   (inactivación de otro gen).

• Niveles de expresión del transgén dependen del sitio de integración y no son regulados como los del gen endógeno, expresión ectópica.  Efectos posicionales.

• Es necesario generar varias líneas transgénicas para tener certeza de que el fenotipo observado se debe al transgén.

• En general modelos de ganancia de función.

GENE TARGETING O “CIRUGÍA GENÉTICA”

    Gene Targeting o “cirugía genética” es un término empleado para definir una tecnología que permite la modificación del genoma del ratón de forma dirigida, específica y controlada. Con esta tecnología no introducimos nuevos genes, modificamos un gen propio en el sitio (cromosoma) en el que está. 

    Tres procesos son esenciales:

• La utilización de líneas de células madre embrionarias del ratón, células ES (Embryonic Stem), como vehículo de transferencia génica a la línea germinal del ratón. Una célula ES es capaz de integrarse en la masa celular interna de un blastocisto y dar lugar a cualquier tejido de un ratón.

• Manipulación genética de las células ES mediante procesos de recombinación homóloga de DNA. El ADN está constituido por dos cadenas de nucleótidos complementarios. En nuestras células dos moléculas de ADN interaccionan por complementariedad de bases alineando sus secuencias homólogas  y se combinan un proceso de rotura y unión. A este proceso se le conoce como recombinación homóloga y es necesario para la reparación del ADN en nuestras células. Este proceso se da especialmente durante la meiosis y es fundamental para el mantenimiento de la diversidad genética.

• Capacidad de seleccionar en cultivo estos procesos de recombinación homóloga antes de introducirlos en el ratón. Al modificar las células ES introducimos en ellas genes que les confieren resistencia, por ejemplo,  a ciertos antibióticos, así sólo las que hayan incorporado estas modificaciones pueden crecer en un medio de cultivo con éstos.

MODELOS KNOCK-OUT (KO)

    Consiste en eliminar la expresión de un gen dentro del genoma. Para ello se prepara in vitro “un vector de ADN” que puede ser introducido en el genoma si está flanqueado con secuencias homólogas (brazos de homología) a las endógenas.

    Podemos remplazar por recombinación homóloga las secuencias de un gen diana que se quiere eliminar y en su lugar podemos introducir un gen marcador de selección positiva, por ejemplo uno de resistencia antibiótica como es Neo, que confiere resistencia al antibiótico neomicina. En muchas ocasiones basta con sustituir por recombinación homóloga un exón del gen diana para inactivar todo el gen.

    Se prepara el vector y se pone con células ES en suspensión. Se aplica un choque eléctrico (electroporación) que crea poro en la membrana de las células ES permitiendo que entre el vector. Posteriormente se ponen estás células en cultivo y se añade el antibiótico de selección. Sólo aquellas células que hayan incluido el gen de resistencia pueden crecer, el resto mueren.

    Además se suele añadir un segundo marcador, en este caso de selección negativa,  en los extremos de los brazos de homología del vector de ADN. El más comúnmente utilizado es el gen timidina quinasa del herpes virus. Las células ES que incluyan este marcador son sensibles al antiviral ganciclovir y mueren. Está segunda selección nos permite distinguir procesos de recombinación homóloga en el gen diana de integraciones al azar, donde toda el vector, incluido el gen de selección negativa, se integran.

    Estas células ES “recombinantes” se introducen en blastocistos. Existen varios métodos, el más común es la microinyección. Las células ES recombinadas al microinyectarlas se integrarán en la masa celular interna del blastocisto y formarán parte del nuevo embrión. Este ratón se dice que es una “quimera” ya que estará formado por dos tipos de células. Si nuestras células recombinantes provienen de una cepa de ratón de pelaje marrón y el blastocisto de una cepa de pelaje blanco, tendremos una quimera marrón y blanca. Al igual que ocurre en la piel de las quimeras, donde están presentes los dos tipos de células, lo mismo ocurre en las gónadas. Como tenemos dos copias de cada gen y sólo modificamos una, ya que la recombinación homóloga es un proceso poco frecuente, el 50% de las crías marrones de estas quimeras serán recombinantes.

            A base de cruces con estos ratones podemos eliminar las dos copias de un mismo gen, en ese caso decimos que tenemos un ratón “Knock-Out” (KO). Estos modelos nos permiten el:

• Estudio de la función génica in vivo en el contexto del animal completo

• Obtención de modelos de enfermedades genéticas.

• Validación de nuevas dianas de intervención terapéutica

    Sin embargo estos modelos tienen sus limitaciones:

• Posible letalidad embrionaria o perinatal lo que impide el estudio de la función de ese gen particular en animal adulto.

• La modificación está presente en todas las células

• La modificación está presente desde la fecundación, de forma que en algunos casos, la plasticidad durante el desarrollo embrionario puede conducir a una interpretación confusa de los resultados por fenómenos de compensación.

    Si pensamos en modelos tumorales podemos hacer animales KO para el estudio de los genes supresores de tumores y los genes de reparación del ADN. Además, los modelos KO nos sirven para evaluar posibles dianas terapéuticas.

MODELOS KNOCK-IN (KI)

    En estos modelos en lugar de eliminar un gen por remplazamiento con otro  como ocurre en los KO, lo que hacemos es insertar por recombinación homóloga nuevas secuencias a nuestro gen de estudio. Por ejemplo podemos introducir un IRES (sitio de entrada interno de ribosoma) y un “gen reportero” como es la betagalactosidasa (LacZ). Estos genes reportero pueden estar fusionados a genes de resistencia antibiótica para permitir la selección positiva de las células ES modificadas.

    El IRES es una secuencia extraída de virus que permite que un ribosoma entre en el ARN mensajero de nuestro gen modificado y codifique para dos proteínas, el gen de estudio y el gen reportero. El IRES ha de ser introducido en sitios específicos en el gen (entre el codon STOP y el sitio de poliadenilación).

    Las células de nuestro ratón que expresen nuestro gen de estudio pueden ser detectadas por una tinción específica (Xgal) para la betagalactosidasa (LacZ).

    Con estos modelos KI podemos introducir mutaciones activantes dentro de un proto-oncogén y convertirlo en un oncogén. De este modo se eliminan los inconvenientes de los animales transgénicos convencionales (sobreexpresión, sitio de integración,…). El problema es que no podemos predecir el comportamiento de un oncogén en el desarrollo embrionario. Como ocurre con los modelos KO, las modificaciones que introduzcamos afectan a todas las células del individuo.

MODELOS CONDICIONALES

    Muchos modelos generados por recombinación homóloga no son viables. Como hemos visto anteriormente esto puede ocurrir si eliminamos un gen vital al hacer un modelo KO o si las modificaciones que añadimos a un modelo KI alteran el desarrollo embrionario normal.

    Salvo en ciertos tipos de cáncer hereditario, las mutaciones en el ADN que aparecen en los tumores son adquiridas a lo largo de la vida. En el modelo animal ideal en Oncología deberíamos poder activar las mutaciones de nuestros oncogenes o eliminar nuestros genes supresores y de reparación del ADN en el animal cuando ya es adulto y en un número limitado de células, en un tejido específico, mimetizando así lo que ocurre en humanos.

    A principios de los años noventa se produjo una nueva revolución con la introducción de recombinasas sitio-específica. Estas recombinasas se han aislado de varios virus, fagos y levaduras.

    Estos enzimas reconocen secuencias específicas  (o “sitios”) en el ADN y realizan una reacción de recombinación que tiene como consecuencia la eliminación del ADN comprendido entre ambos sitios. Existen varias recombinasas y estas sólo reconocen determinados sitios. Estos sitios son pequeños, de 34 pares de bases. El sistema más comúnmente utilizado es el de la recombinasa Cre y los sitios LoxP.

    Existen recombinasas modificadas por ingeniería genética que son inducibles, esto es, que sólo son activas y escinden las secuencias de ADN comprendidas entre dos sitios LoxP si está presente un determinado sustrato. Existe, por ejemplo, una recombinasa Cre fusionada a un receptor de estrógenos modificado genéticamente. Éste cambia su conformación estructural cuando se une una molécula de 4-OH-tamoxifeno permitiendo la recombinasa escindir las secuencias comprendidas entre sitios LoxP.

    La colocación y orientación de estos sitios determinan el segmento de ADN a eliminar. Estos sitios los tenemos que incluir en el vector de recombinación. La disponibilidad espacio-temporal la determina la recombinasa utilizada.  Existen muchos animales transgénicos que espresan la recombinasa Cre bajo promotores específicos (de queratinocitos, hepatocitos,...).

    Podemos hacer un KO condicional si por recombinación homóloga flanqueamos con sitios LoxP uno o varios exones esenciales de un gen.

    Podemos introducir por recombinación homóloga una mutación activante en un proto-oncogén y mantenerla “apagada” por cassette de parada transcripcional (STOP)  flanqueado por sitios LoxP. Sólo cuando Cre sea activa reconocerá los sitios LoxP y escindirá el cassette STOP permitiendo la expresión de nuestro gen mutado.  Además podemos añadir un IRES con un gen reporter para identificar las células que están expresando la forma mutada del proto-oncogén.

EL FUTURO                       

    En la actualidad se están desarrollando sistemas para visualizar genes reporteros. Esto nos permite validar más eficientemente nuevos drogas anticancerosas ya que podemos evaluar su potencial terapéutico en un mismo animal sin necesidad de sacrificarlo. Día a día se descubren nuevas herramientas de ingeniería genética que hacen que podamos generar vectores de ADN más complejos en un tiempo menor.

    La generación de estos nuevos modelos nos permiten investigar algunos aspectos que no han sido posibles estudiar anteriormente como son el estudio de las etapas involucradas en la iniciación y progresión tumoral ya que conocemos el evento iniciador. Además éste ocurre bajo condiciones fisiológicas (sin sobre expresión). Podemos estudiar la cooperación con otros oncogenes y genes supresores de tumores necesarios para la progresión y supervivencia de un tumor (y tal vez para invadir y metastatizar). Con estos modelos podemos identificar las células permisivas que originan y mantienen el tumor (“Cancer Stem Cells”). También se están empleando en la búsqueda de nuevos marcadores tumorales para un mejor diagnóstico y más precoz. El uso de estos modelos está siendo esencial para la validación de dianas terapéuticas y el diseño de nuevos fármacos lo que en un futuro permitirá una terapia más dirigida y específica para el tratamiento del cáncer.

BIBLIOGRAFÍA

• Andras Nagy et al . “Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual”.

• Cold Spring Harbor Laboratory Press.

• Guerra C. et al Cancer Cell 2003 Aug;4(2):111-20 “Tumor induction by an endogenous K-ras oncogene is highly dependent on cellular context”.

• http://www.nature.com/nature/mousegenome/index.html

• http://www.cnio.es

Autor: Alberto Jiménez Schuhmacher.  Bioquímico del Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO)   Esta dirección de correo electrónico está protegida contra los robots de spam, necesita tener Javascript activado para poder verla