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INTRODUCCIÓN Pocas áreas de la Biología Molecular han permanecido inalteradas con la aparición de una serie de técnicas englobadas dentro del término genérico de Ingeniería Genética y referidas indistintamente como clonaje, DNA recombinante o manipulación genética. Antes del desarrollo de la Ingeniería Genética no era posible aislar un gen concreto eucariótico en cantidades suficientes para su estudio molecular o el de su producto. LAS ENZIMAS Existen muchas enzimas que intervienen decisivamente en distintos procesos de la Biología Molecular. Entre ellas podemos destacar: Endonucleasas de restricción: Son enzimas que hidrolizan los ácidos nucleicos rompiendo enlaces internucleotídicos del interior de la cadena. Las endonucleasas de restricción son enzimas producidas principalmente por bacterias que hidrolizan enlaces fosfodiester del esqueleto de DNA de doble hebra en secuencias específicas. Las endonucleasas de restricción de tipo II son las más útiles en los métodos de DNA debido a su especificidad de secuencia absoluta, tanto para la reacción de unión como para la de ruptura. Las enzimas de restricción se denominan con tres o cuatro letras que corresponden a la primera letra del género y a las dos o tres primeras letras de la especie del organismo de procedencia. El número señala el orden cronológico de descubrimiento de esa enzima en esa estirpe. Casi todas las secuencias nucleotídicas reconocidas por las endonucleasas de restricción poseen un eje de simetría impropio binario, esto es, la lectura de la secuencia en ambas direcciones es la misma, lo que recibe el nombre de palíndromos. La rotura se produce en ambas hebras de DNA siendo esta simétrica respecto al eje binario. Las endonucleasas de restricción cortan el DNA generando, bien extremos 3´ o 5´ monocatenario, de unos cuatro nucleótidos de longitud, denominados extremos cohesivos, o bien extremos romos.  Polimerasas: Son enzimas capaces de sintetizar DNA o RNA “in vitro”. La mayoría de estas enzimas requieren un molde y sintetizan una molécula complementaria al molde. Las polimerasas utilizadas con mayor frecuencia son: DNA polimerasa I de E. coli, el fragmento de Klenow, transcriptasa inversa (utiliza como molde RNA para convertirlo en DNA), la DNA polimerasa del bacteriofago T7, RNA polimerasa de los bacteriofagos SP6, T7 y T3 y la Taq polimerasa (enzima empleada en la reacción en cadena de la polimerasa). La mayoría de las polimerasas necesitan un pequeño cebador o primer complementario al DNA molde para iniciar la polimerización a partir de ese punto. La transferasa terminal es una polimerasa que no requiere molde y que añade nucleótidos exclusivamente a los extremos de las cadenas preexistentes. Todas ellas requieren Mg2+. Otras enzimas: Ligasas (une extremos de DNA protuberantes o romos), Fosfatasas (eliminan el fosfato de la región 5´ de los ácidos nucleicos, quinasas (incorporan fosfatos en el extremo 5´ que han dejado las fosfatasas) etc... Consiste en la obtención de un gran número de fragmentos idénticos a partir de uno original. Para ello se aísla primero el fragmento de DNA que se quiere clonar, se liga a un transportador o vector (plásmidos, fagos , cósmidos etc..) que tras introducirlo dentro de una célula va a permitir su replicación por cultivo. Una vez replicado considerablemente se recupera junto con el vector correspondiente y posteriormente se le separa del vector, obteniendo como resultado un gran número de copias del fragmento de interés.  
Es un método que permite la separación de moléculas en base a su tamaño. Esta separación se realiza en un gel, que es una malla compleja de moléculas poliméricas. Los geles pueden ser de agarosa o poliacrilamida. La agarosa es conveniente para separar fragmentos de ácidos nucleicos en el rango desde unos pocos cientos, hasta aproximadamente 20000 pares de bases. La poliacrilamida es preferible para la separación de fragmentos más pequeños de ácidos nucleicos. El fundamento de esta separación está basado en que las moléculas de ácidos nucleicos están cargadas negativamente (al pH y condiciones del tampón en el que se encuentran) y al someterlas a un campo eléctrico migran hacia el polo positivo de este a través del gel, a velocidades que dependen de sus tamaños: una molécula pequeña puede seguir su camino a través del gel más fácilmente que una molécula grande. Las velocidades de migración de las moléculas de ácidos nucleicos, son inversamente proporcionales a los logaritmos de sus pesos moleculares (Aaij y Borst). La detección tras la migración se realiza fácilmente gracias al empleo de un colorante intercalante (se intercala entre las bases de los ácidos nucleicos) que contiene el propio gel y es visualizado al emitir luz visible cuando el gel se ilumina con luz ultravioleta. Un factor a tener en cuenta para valorar la migración de los ácidos nucleicos en un gel además de su tamaño es la configuración espacial que adopte la molécula. 
El peso molecular de los ácidos nucleicos se mide con las siguientes unidades: - DNA: en pares de bases o bp. - RNA : en nucleótidos o nt. - Proteínas: en Daltons o Da.
Es un proceso de unión de dos hebras complementarias de ácidos nucleicos pero cuyo origen es distinto. Una de ellas será el ácido nucleico diana y la otra será la sonda empleada para localizar ese ácido nucleico diana. 
¿Qué es una sonda? Una sonda es un fragmento monocatenario de DNA o RNA marcado con una molécula reporter, y que se emplea para el reconocimiento específico de una molécula determinada de ácido nucleico diana de cadena sencilla, en un proceso de hibridación. Existen tres tipos de sonda de ácidos nucleicos: - Fragmentos de DNA - Fragmentos de RNA - Oligonucleótidos sintéticos u oligosondas.
¿Qué son las moléculas reporter?
Son moléculas químicas unidas a la sonda y que van a permitir la detección de esta tras un proceso de hibridación. Existen moléculas reporter de muchos tipos: radiactivas (32P, 35S), de afinidad (Biotina, Digoxigenina...), enzimáticas (Fosfatasa, Peroxidasa ...) y quimioluminiscentes (ésteres de acridina).  ¿Qué factores afectan a la sensibilidad y especificidad de la reacción de hibridación? - Concentración del ácido nucleico diana - Complementariedad sonda-ácido nucleico diana - Concentración de la sonda. - Longitud de la sonda - Actividad específica de la molécula reporter. - Condiciones de hibridación (pH, fuerza iónica, temperatura de hibridación, ...) - Tm - Acceso al ácido nucleico diana. - Formato de hibridación
¿Cuales son los formatos de hibridación?
- Hibridación en solución: La sonda y el ácido nucleico diana se encuentran en una solución líquida. Las condiciones de hibridación deben ser rigurosas. La velocidad de formación del duplex en estas condiciones es alta. El problema de este tipo de hibridación es la eliminación de la sonda que no ha reaccionado, empleándose entre otros métodos la nucleasa S1-precipitación con tricloroacético o la hibridación protection assay. - Hibridación en fase sólida: El ácido nucleico diana o bien la sonda se encuentran inmovilizados en filtros. Estos pueden ser de nitrocelulosa (fijación por calor) o de nylon (fijación por luz ultravioleta). Una vez realizada la fijación se añade la sonda marcada que buscará su secuencia complementaria en el ácido nucleico diana que queremos identificar. La sonda que no reacciona, híbridos inestables o uniones inespecíficas son eliminados mediante lavados. Su sensibilidad es menor que la hibridación en solución.
Actualmente también se ha conseguido fijar los ácidos nucleicos al plástico de las placas de microtitulación. Existe un tipo de hibridaciones en fase sólida que son muy empleadas en Biología Molecular: los Southern blot (DNA cortado con enzimas de restricción e hibridado con una sonda de DNA) y Northern Blot (RNA separado e hibridado con sondas de DNA o RNA). Estas técnicas consisten en una separación inicial de las moléculas en base a su peso molecular mediante electroforesis , trasferencia capilar de estas moléculas a un filtro de papel o de nylon, fijación, hibridación con la sonda de interés y detección. 
Hibridación in situ
Permite la detección de genes o expresión de genes dentro del contexto morfológico de la célula o tejido. Para conseguirlo se requiere que el ácido nucleico sea liberado de su entorno celular para tener acceso la sonda, pero preservando la morfología para la consiguiente interpretación y análisis. Para ello se emplean fijadores especialmente de entrecruzamiento, como la formalina, paraformaldehido, glutaraldehido. El empleo de proteasas, que facilitan el acceso de la sonda al ácido nucleico diana debe ser realizado cuidadosamente para no provocar el desmantelamiento de la morfología celular. Se recomienda el empleo de oligosondas. Sondas de PNA (Peptide Nucleic Acid) Fueron inventadas en 1990 por un grupo de científicos daneses (Buchardt, Berg, Nielsen, Egholm). Son una nueva clase de sondas híbridas entre ácido nucleico y proteínas, diseñadas para la detección de secuencias específicas de ácidos nucleicos. Su estructura esta formada por una cadena de aminoácidos que forman el esqueleto principal, y a los cuales se les unen las bases nitrogenadas, siguiendo los parámetros conformacionales descritos por Watson y Crick. Las bases (A,T,C,G) están colocadas a la misma distancia que en el DNA Esta estructura hibrida le confiere una serie de características especiales: - Son moléculas de simple cadena - No están cargadas siendo el esqueleto principal flexible. - Sus hibridaciones son rápidas, específicas y sensibles. - Presentan una especificidad y sensibilidad mas elevada que los oligomeros DNA/RNA - Hibrida bajo condiciones donde el DNA no puede. - Enlaces más fuertes - Moléculas muy estables y no son degradadas por proteasas ni nucleasas.
SECUENCIACION DE LOS ACIDOS NUCLEICOS La introducción de métodos rápidos de secuenciación a finales de los años 70 representó un cambio importante en los estudios sobre el DNA Existen dos métodos de secuenciación de los ácidos nucleicos. Uno de ellos (Maxam y Gilbert) utiliza reactivos químicos a fin de cortar el DNA a nivel de bases específicas. El otro se denomina enzimático, de terminación en cadena o didesoxi (Sanger, Nicklen y Coulson). El fin de ambos es conseguir la secuencia completa de cada una de las bases que constituyen un fragmento de ácido nucleico. En el método químico un fragmento de DNA se marca en uno de sus extremos con P o S radiactivo por acción de la enzima polinucleótido quinasa. Ambos extremos se separan por la acción de una enzima de restriccion. El paso siguiente consiste en romper estos fragmentos, no más de una o dos veces por molécula, con reacciones químicas específicas para cada una de las cuatro bases. Haremos cuatro alícuotas y trataremos cada una de ellas con un compuesto químico que modifique una de las cuatro bases, aproximadamente una vez por molécula de DNA. El tratamiento posterior con piperidina producirá la rotura de la cadena allí donde la base había sido alterada. Especificidad Base Reactivo G Dimetil sulfoxido G+A Acido fórmico T Permanganato Potásico C Hidroxilamina
Posteriormente se analizan los fragmentos en geles desnaturalizantes El método enzimático es el más utilizado en la actualidad. Se prepara un DNA circular lineal (clonando en el fago M13). Se introduce un cebador que va a servir para el inicio de la síntesis del DNA que vamos a marcar y a secuenciar. El cebador es específico a una secuencia complementaria del fago M13. Una polimerasa (enzima de Klenow o secuenasa) se encarga de polimerizar. Se establecen cuatro alícuotas. La síntesis se lleva a cabo en dos pasos: en la primera parte del proceso el cebador se alarga unos cientos de nucleótidos utilizando para ello los cuatro nucleótidos, pero uno de ellos está marcado. En el segundo paso se produce la terminación de las cadenas por la adición de una pequeña cantidad de un dideoxinucleótido distinto en cada alícuota. El dideoxido es un nucleótido trifosfato que por carecer de grupos OH tanto en el carbono 2´como el 3´de la ribosa lo que imposibilita el crecimiento de la cadena y paraliza la síntesis. El resultado en cada tubo de ensayo es una colección de fragmentos, de tantos tamaños como unidades de la base existan en la secuencia. Los distintos fragmentos se analizan por electroforesis en geles de acrilamida. Actualmente para el marcaje se utilizan cuatro fluorocromos distintos: fluoresceina, NBD(4-cloro-7nitrobenceno-2oxal-diazol), tetrametilrodamina y rojo texas, uno para cada base. . Una vez conjugados a cuatro alícuotas del cebador, se procede a la extensión del iniciador e interrupción con dideoxis. 
Geles de secuenciación TECNICAS DE AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS
Se reúnen con esta denominación una serie de técnicas que nos van a permitir un aumento considerable en la detección de secuencias específicas de los ácidos nucleicos
Amplificación de la diana - PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) - 3SR (Self sustaining sequence replication) - NASBA (Nucleic acid sequence based amplification) - SDA (Strand displacement amplification)
- Qbeta replicasa - LCR (Ligase chain reaction)
Amplificación de la señal
- Branched probe - Gen point (hibridación in situ)
EL DIAGNOSTICO DEL FUTURO - Muestra = Extracción de A.N.
- Amplificación de zona interés
- Secuenciación
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Autor: Miguel Angel Dasi. Bioquímico. |
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